新光學顯微鏡技術揭示活細胞生物過程

　　新技術所拍攝的視頻生動地展現了細胞內蛋白質的運動和相互作放大鏡用。它們幫助生物學家理解細胞是怎樣改變它們之間的依存結構，以及重整細胞膜結構使得細胞外的分子可以被吸收到細胞內。來自Janelia研究園的研究員EricBetzig博士，李棟博士後*和他們的同事們基於原有的SIM顯微鏡原理新發展了兩種新的超分辨率成像技術。超分辨率光學顯微成像技術能夠跨越理論的分辨率極限，在極高的分辨率下展現細胞內的精細結構。但是，到目前為止，超分辨率顯微鏡技術卻依然不能進行有效的活體細胞成像。
　　“這些方法設立了超分辨率光學顯微鏡的成像速度和非侵入特性的新標准，它們使得超分辨率活體細胞成像成為現實。”Betzig博士說道。在傳統的SIM顯微鏡中，物鏡下的物體被非均勻的結構光（類似於條紋碼）所照明。在實驗中，幾束不同的結構光用來照明物體，它們和物體在不同角度混頻所產生的摩爾條紋被相機依次采集。然顯微鏡後計算機提取摩爾條紋編碼的信息並將其解碼生成三維的高分辨率圖像。最終重建的SIM圖像具有高於傳統顯微鏡圖像2倍的空間分辨率。

　　Betzig博士和其他兩位科學家因為發展超分辨率熒光顯微鏡而被授予2014年諾貝爾化學獎。他說道，SIM顯微鏡技術之所以沒有得到像其它方法那樣多的關注，是因為其它技術能夠提供比兩倍更高的分辨率改進效果。但是，他強調SIM擁有兩大其它的超分辨率方法所沒有的優勢。這些其它方法包括了兩種去年獲得諾貝爾獎表彰的技術：他和同事HaraldHess博士於2006年開發的光激活定位顯微鏡（photo activ望遠鏡ated localization microscopy，PALM），和受激輻射耗盡（stimula ted emission depletion，STED）顯微鏡。但是，這兩種技術都需要過多或過強的光來照明樣品，以至於熒光蛋白很快被漂白，細胞樣品很快被損害，從而不可能長時間進行成像。然而，SIM在這些方面不一樣，“我愛上了SIM，因為它的速度很快，而且它所需的照明光強度遠遠小於其它方法。”Betzig博士說道。

　　Betzig博士在2011年Mats Gustafsson博士去世後不久開始與SIM相關的研究。Gustafsson博士是SIM技術的先驅之一，生前也是Janelia的研究員。Betzig博士那時已經深信SIM有潛力為解析細胞內部的工作機理提供重要的見解，如果SIM的空間分辨率可以被提高，它對於生物研究的可用性將被大大增強。

　　在生前，Gustafsson博士和博士生HesperRego發展了一種利用飽和耗盡（saturateddepletio天文望遠鏡n）的非線性SIM技術，但這種技術在改進分辨率的同時需要使用很多的光照並且散失了SIM成像速度快的優勢。Betzig博士想到了一種可以避免這些缺陷的方法。

　　飽和耗盡非線性SIM利用光可反復開關的熒光蛋白和其在開關過程中的飽和耗盡金相顯微鏡效應來提高分辨率。它產生圖像的過程是，首先把所有的熒光蛋白分子激活到可發光的狀態（亮態），然後用一束結構光把大部份的亮態分子反激活到暗態。通過結構光反激活之後，僅有少數處於結構光最弱區域的分子仍然保持在亮態。這些光調控過程提供了物體的高空間頻率信息，從而讓圖像更加清晰。這一過程需要重復25或更多次才能產生最終的高分辨率圖像。Betzig博士說道，這一原理非常類似於STED或另一種與其相關的叫做RESOLFT的超分辨率技術的原理。

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